在过去的二十年里，芯片破解二次谐波（Second harmonic generation, SHG）显微镜已成为光学成像的关键方法，在材料和生物医学科学中有许多应用[1]。SHG基于二阶非线性光学过程，只有在具有非中心对称结构的物质中产生信号，这一特殊的成像要求使得SHG显微镜具有高度特异性。胶原蛋白是人体组织中最常见的蛋白质之一，在分子尺度上，胶原蛋白由三条α链组成，在某些胶原类型（主要是 I 型和 II型）中，这些三螺旋自发地自我组装成高度有组织的胶原纤维，从而产生非常强的 SHG 信号，而非纤维胶原（如IV型）无法通过SHG显微镜成像。

图1 胶原蛋白的层次结构[1]SHG过程的相干性使得SHG图像中蕴含着生物样本丰富的信息，下面简述几种先进SHG显微镜技术[1]。

Forward over backward second harmonic generation (F/B?SHG) [1]SHG信号一般分为前向F-SHG (Forward SHG, F-SHG)信号和后向B-SHG (Borward SHG, B-SHG)信号。由于SHG信号的产生是一个相干过程，因此相位信息至关重要。在生物样本中一般很难满足相位匹配条件，对于F-SHG 信号，相干长度L_C（几微米）较大，能较好地展示在SHG波长量级的有序结构，而B-SHG信号的相干长度L_C（几十纳米）较小，因此纯B-SHG一般非常微弱，能很好地展示更小的一些结构。F/B?SHG显微镜能够充分利用SHG辐射模式方向性的优势。芯片破解说明随着偶极子（绿色箭头）在焦点体积处的堆叠，相比于B-SHG，F-SHG强度会更大。图2(e, f)分别是肌腱组织前向和后向SHG图像，图2(g, h)分别表示沿着纵向和横向两个方向时，前向和后向SHG信号的变化。

Polarization?resolved second harmonic generation (P?SHG)[1]胶原纤维一般为圆柱形，如果输入激光为线偏振光且沿着z轴传输，线偏振光相对于x轴的偏振角度为μ，胶原纤维相对于x轴的方位角为θ（具体见图3(a)），那么图像中每个像素的SHG信号强度如下：公式(1)说明改变入射光偏振角度会极大地影响SHG信号强度，SHG信号强度中包含生物组织大分子的取向信息。芯片破解P-SHG 结合了 SHG 显微镜（高特异性和高对比度）和偏振测量法（对分子排列的敏感性）的优点，可以应用于胶原蛋白，能更准确地揭示图像平面上纤维的复杂层次结构。图3(a)是P-SHG显微镜装置图，其中1/4波片和半波片起到优化激光线偏振程度和改变线偏振光偏振角度的作用，图3(b)是利用P-SHG显微镜量化平面内胶原纤维取向的结果示例。